本文第一通讯作者谢黎炜研究员为广东省科学院和广东省微生物研究所海外高层次人才引进的肠道微生态与健康学科带头人（南方医科大学珠江医院特聘教授，博士生导师），主要开展肠道微生态与代谢疾病和健康相关的研究。谢黎炜老师长期与百迈客合作，2018年，在我们举办的第五届全国功能基因组学高峰论坛中并做了非常精彩的报告。
2019 年8 月，谢黎炜老师在Frontier in Microbiology 杂志上发表了题为《Gut microbiota as a subjective measurement for auxiliary diagnosis of insomnia disorder 》的研究论文，首次以临床失眠障碍的患者为研究对象，开展了失眠障碍与肠道菌群关系的系统性研究。
失眠是最常见的睡眠障碍，并且近年来研究表明失眠与各种疾病相关，如肥胖症，II型糖尿病和心血管疾病等。失眠像许多其他精神疾病一样，是一种多因素疾病。肠道微生物是肠道环境的关键组成部分，已被认为是人类健康的必需调节剂。微生物稳态对宿主的发育和健康至关重要。微生物菌群失调也可能导致神经系统疾病和精神疾病的发展，如自闭症谱系障碍，焦虑症，抑郁症和阿尔茨海默病。目前，失眠与肠道菌群之间关系的研究仍未得到探索。因此，本研究结合16S rDNA扩增子测序和创新生物信息学分析来探讨健康参与者和患有失眠症的患者之间的肠道微生物群落的病理学和生理学意义。
测序样本：失眠组和正常对照组，每组10人生物学重复，粪便样本，共20个样本。
微生物多样性测序平台：Illumina HiSeq 2500
微生物多样性测序区域：16S V3+V4
1、失眠导致肠道微生物群落结构和功能显著变化
本研究对失眠和正常对照组的测试结果显示，所有样本16S rDNA V3-V4区域扩增子测序产生1,534,966个high-quality reads，每个样品平均reads数为76,748。本研究通过α多样性、β多样性初步诠释样本间差异（图1A,B）。为了确认两组之间差异的组成，使用曼哈顿图来表示失眠/正常组的显著差异程度，显著性差异最大的是是厚壁菌门和拟杆菌门，并通过LEfSe分析鉴定了两组间存在87种显著性差异物种（图1C,D）。同时，基于BugBas预测表明，与正常组相比，失眠组富含较多的革兰氏阴性和潜在致病性分类群（图1E）。为了预测肠道菌群中功能基因的组成情况，利用PICRUSt预测分析的热图来表示两组间在KEGG途径中差异（图1F）。
图1：失眠导致肠道微生物群落结构和功能显著变化
2、失眠导致肠道微生物群落结构变化
本研究通过网络图描述了门水平上细菌群落之间的相互作用关系。由图可知失眠患者的肠道微生物群具有已经发展成熟的网络。与正常组相比，失眠症患者的肠道菌群网络图有显著改变。正常组肠道微生物群落分为5个亚组，失眠组肠道微生物群落分为4个亚组。
图2：正常组和失眠患者网络图
3、肠道菌群变化严重影响失眠症症状
为了进一步证明失眠相关的临床睡眠参数是否直接导致肠道微生物群的改变，进行了RDA分析，将临床失眠参数与门水平的肠道微生物群的相对丰度联系起来（图3）。临床睡眠参数（共12个环境因子）：多导睡眠图（PSG）和心理量表，包括匹兹堡睡眠质量指数（PSQ），体重指数（BMI），总睡眠时间，睡眠效率，睡眠潜伏期，具有高度相关性睡眠开始后醒来的时间（WASO数，WASO时间），快速眼动（REM），快速眼动潜伏期（REM潜伏期）和非快速眼动阶段（N1，N2，N3）。RDA和ANOISM分析都清楚地表明，与失眠症相关的临床睡眠参数直接有助于组间肠道微生物群的分离和聚集。
图3：肠道菌群与临床数据RDA相关性分析
4、用随机森林识别与失眠症相关的特征性肠道微生物
LEfSe鉴定出87种与失眠相关的生物标志物，但是难以使用这些标志物建立疾病诊断的预测模型。因此，为了更好的筛选出与失眠相关最有价值的菌种，进一步使用了随机森林和交叉验证的方法确定了三种与失眠症相关的特征性肠道微生物（Prevotella，Bacteroides，Clostridiales）
图4：随机森林交叉验证模型筛选特征菌种
5、肠道微生物群预测临床睡眠参数的相对丰度
本研究采用了人工神经网络的方法，训练出基于肠道菌群种级别数据对各种睡眠数据预测的神经网络模型（图5）。
图5 基于肠道菌群的神经网络预测分析
本研究主要利用微生物多样16S V3+V4测序研究正常对照组和失眠组之间的物种差异。本研究中提出的模型利用尖端生物信息学算法不仅支持失眠与正常健康之间的差异，同时利用人工神经网络建立了基于肠道微生物群相对丰度的失眠诊断和睡眠质量评估预测模型。该研究首次将高通量测序和生物信息学分析结合起来，系统地了解肠道微生物群对失眠的生物学效应。综合分析表明，肠道微生物稳态是一个强有力的决定因素，与失眠症密切相关。今年，我们很荣幸再次邀请到了谢黎炜老师参加“第六届全国功能基因组学高峰论坛”，将继续为大家带来精彩报告，敬请期待！
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